基金申请的策略和技巧

大宇

基金申请的策略和技巧
黎 明 涛

中山大学蛋白质组学研究中心
中山大学基础医学院药理教研室

基金申请
选题

撰写申请书

答辩
撰写前的准备
好心情、好身体  边想边写  3h /天
读指南、读通知  注意截止期
读标书、读高手、读同行
读自己  卖点！？选题 创新性 工作基础
想法变文字  一气呵成   “立项依据”
沟通 科研科87330567、医科处 87333055

摘  要    研究内容和意义（限400字）
1. 基础：继续和深入 发表和未发表 创新
2. 问题 中肯
3. 预实验 针对“问题”的预实验结果
4. 假设 思想性、创新性
5. 方法 可靠性第一 先进性第二
6. 目标 明确、具体
7. 意义 理论性和应用性
立  项  依  据
1. 关键! 占50% 文笔流畅、层次分明、逻辑性强
2. 要求：充分的理由和意义 思想性 与摘要呼应
3. 自己的工作为依据  图文并茂 规范
4. 参考文献  时效性 自己的文章 规范化
5. 深入浅出  内行、外行读得懂  
6. 人文文化  素质 精神 动人的故事


神经元凋亡时SP1对BH3-only蛋白Bim的转录调控
细胞凋亡    时SP1对BH3-only蛋白Bim的转录调控
神经元凋亡时           BH3-only蛋白Bim的转录调控
神经元凋亡时SP1对BH3-only蛋白Bim的        调控
                        SP1对BH3-only蛋白Bim的转录调控
                        SP1对神经元凋亡的调控作用

关键词：SP1/Bim /基因调控/信号转导/神经元凋亡

研究内容、研究目标与拟解决的关键问题
神经元凋亡时SP1对BH3-only蛋白Bim的转录调控
研究目标
获得SP1直接调控bim基因表达的可靠证据，阐明促凋亡蛋白Bim由SP1转录调控的新机制，为确立SP1作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分的科学依据。
要求：明确、具体  解决学术问题

   研究内容 （紧紧围绕研究目标）
      1.  证明bim启动子核心区的SP1结合序列是否介导了bim基因的上调   为了证实bim启动子核心区的SP1结合序列是否介导了bim基因的上调，将其中的SP1结合序列进行点突变，使其不能结合SP1；确定这一突变是否能够消除bim启动子的撤钾反应。
     2.  分析SP1 是否能够与bim启动子核心区的SP1结合序列结合  应用EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)技术，证实bim启动子核心区的SP1 结合序列是否能够与SP1结合；进一步采用CHIP(Chromatin immunoprecipitation)方法，获得SP1与bim启动子核心区在细胞内结合的证据。
     3.  从 bim 的mRNA 和蛋白质水平，观察负显性SP1是否能够抑制撤钾诱导的bim基因的上调  质粒转染CGNs的转染率只能达到0.1-1.0 %，腺病毒的感染率可达70－80%[1]。 因此，构建dnSP1的腺病毒载体Ad-dnSP1，感染CGNs才能达到可靠分析bim的mRNA和蛋白质表达水平改变的目的。
  4. 分析SP1诱导Bim这一机制对神经元凋亡的调控作用  确立SP1转录激活bim这一机制后，进一步分析这一机制对神经元凋亡的调控作用。

   拟解决的关键问题    获得SP1直接调控bim基因表达的可靠依据。

    什么是关键问题？
     — 研究过程中对达到预期目标有重要影响的某些研究内容或因素。
     — 为达到预期目标所必须掌握的关键技术或研究手段。



            研  究  方  案
项目需求为前提；
可靠性第一，先进性第二；
参考文献；
突出关键技术的描述；
不主张使用流程图，建议开头：“有关方法、技术路线、试 验手段、关键技术综述如下……”。


可行性分析              －从学术思想角度提出
         1.  工作基础 （学术思想）
        2.  科研梯队
        3.  实验条件
        4.  实验技术
        5.  交流与合作（国内、国外）


  研究基础与工作条件   —突出与项目相关的工作积累
研究基础 已取得的研究工作成绩及与本项目有关的研究工作积累(对于自由申请项目，着重填写申请人近期的主要工作业绩；对于重点项目，请着重填写本课题组与本项目相关的研究工作积累和近五年的主要研究业绩)
工作条件 已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径(包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况)
研究 基 础
     在国家自然科学基金(已结题三项、正进行一项)的资助下，近五年有如下工作积累和成绩：

    1.   SCI论文   近五年发表了14篇SCI论文；其中与神经元凋亡的信号转导和基因调控有关的论文，作为第一作者的有2篇，作为通讯作者的有4篇(见后)，作为共同作者的有8篇。

  2.  Bim转录机制的前期工作  我们首次报道了神经元凋亡时JNK/c-Jun不参与bim的上调[1]，随后，我们又以可靠的证据揭示了PI3K/Akt/ FKHRL1也不介导bim的上调(未发表资料)。这些研究工作改变了以往的观点,也是本项目重要的立项依据之一。


SCI 文  章
1.        Leyu Shi , Shoufang Gong, Zhongmin Yuan , Chi Ma, Yanling Liu, Chuanfu Wang , Wenming Li, Rongbiao Pi, Shoujian Huang, Ruzhu Chen , Yifan Han , Zixu Mao, and  Mingtao Li(通讯作者). Activity deprivation-dependent induction of the proapoptotic BH3-only protein Bim is independent of JNK/c-Jun activation during apoptosis in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2005, 375：7－12.
2.       Wenya Wang, Chi Ma, Zixu Mao and Mingtao Li. (通讯作者). JNK inhibition as a potential strategy in treating Parkinsons’s disease. Drug News Perspect, 2004, 17(10):646-54.
3.       Wenya Wang, Leyu Shi, Yuanbin Xie, Chi Ma, Wenming Li, Xingwen Su, Shoujian Huang, Ruzhu Chen, Zhenyu Zhu, Zixu Mao, Yifan Han and Mingtao Li. (通讯作者). SP600125, a new JNK inhibitor, protects dopaminergic neurons in the MPTP model of Parkinson’s disease.  Neurosci Res  2004；48:195-202
4.      Yuanbin Xie, Yanling Liu, Chi Ma, Zhongmin Yuan, Wenya Wang, Zhenyu Zhu, , Guoquan Gao, Xianguo Liu, Hengxin Yuan, Ruzhu Chen, Shoujian Huang, Xuelan Wang, Xiaonan Zhu, Xuemin Wang, Zixu Mao and Mingtao Li (通讯作者). Indirubin-3′-oxime inhibits c-Jun NH2-terminal kinase: anti-apoptotic effect in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2004, 367:355-359.

5.     Rongbiao Pi, Wenming Li Nelson T.K.Lee, Hugh H.N.Chan, Yongmei Pu, Ling Nga Chan, Nikolaus J.Sucher, Doanld C. Chang, Mingtao Li and Yifan Han. Minocycline prevents glutamate-induced apoptosis of cerebellar granule neurons by differential regulation of p38 and Akt pathways. J Neurochem. 2004, 91:1212-1230. Wenya Wang, Chi Ma, Zixu Mao and Mingtao Li. (通讯作者). JNK inhibition as a potential strategy in treating Parkinsons’s disease. Drug News Perspect, 2004, 17(10):646-54.
6.     Wenming Li, Rongbiao Pi, Hugh H. N. Chan, Hongjun Fu, Nelson T. K. Lee, Hing Wai Tsang, Yongmei Pu, Donald C. Chang, Chaoying Li, Jialie Luo, Keming Xiong, Zhiwang Li, Hong Xue, Paul R. Carlier, Yuanping Pang, Karl W. K. Tsim, Mingtao Li and Yifan Han. Novel dimeric AChE inhibitor Bis(7)-tacrine, but not Donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking NMDA receptors. J Biol Chem. 2005, 280(18):18179-88.
7.     Xuemin Wang, Xiaoli Tang, Mingtao Li, John Marshall, Zixu Mao. Regulation of neuroprotective activity of myocyte enhancer factor 2 by cAMP-PKA signaling pathway in neuronal survival. J Biol Chem. 2005, 280(17):16705-13.
8.     Marcus Wiedmann, Xuemin Wang, X.iaoli Tang, Mingtao Li, Zixu Mao. PI3K/Akt-dependent regulation of the transcription factor myocyte enhancer factor-2 in insulin-like growth factor-1- and membrane depolarization-mediated survival of cerebellar granule neurons. J Neurosci Res. 2005 2005 81(2):226-234.


9.      Mingtao Li，Xiaomin Wang，Mary Kay Meintzer，Tracey Laessig，Morris J. Birnbaum and Kim A. Heidenreich.   Cyclic AMP promotes neuronal survival by phosphorylation of glycogen synthase kinase 3β. Mol Cell Biol. 2000, 20（24）：9356-9363.
10.    Mingtao Li，Daniel A. Linsenman，Melissa P.Allen，Mary Kay Meintzer， Xiaomin Wang，Tracey Laessig，Margaret E. Wierman & Kim A. Heidenreich. MEF2A and MEF2D undergo phosphorylation and caspase-mediated degradation during apoptosis of rat cerebellar granule neurons. J. Neurosci. 2001; 21(17):6544-6552.
11.   Daniel A. Linseman, Christopher M. Bartley, Shoshona S. Le, Tracey A. Laessig, Ron J. Bouchard, Mary Kay Meintzer, Mingtao Li and Kim A. Heidenreich . Inactivation of the Myocyte Enhancer Factor-2 Repressor Histone Deacetylase-5 by Endogenous Ca2/Calmodulin-dependent Kinase II  Promotes  Depolarization-mediated Cerebellar Granule Neuron Survival. J Biol Chem  2003, 278:41472–41481.
12.   Jing-Ping Yun, Choong-Tsek Liew, Eng Ching Chew, Xiao-Yu Yin, Paul Bo San Lai, Yam Hin Fai, H.K. Richard Li, Mei-Lin Jin, Ming-Xiao Ding, Mingtao Li, Han-Liang Lin, and Wan Yee Lau. Nuclear Matrix Protein Expressions in Hepatocytes of Normal and Cirrhotic Rat Livers Under Normal and Regenerating Conditions.  J Cell Biochem. 2004, 91:1269–1279.


13.  Hongwei Yang, Xiaodong Hu, Hongmei Zhang, Wenjun Xin, Mingtao Li, Tong Zhang,   Lijun Zhou and Xianguo Liu. Roles of CaMKII, PKA, and PKC in the induction and mainternance of LTP of C-fiber-evoked field potentials in rat spinal dorsal horn. J Neurophysiol. 2004, 91: 1122-1133.
14 .  Nengwei Hu, Hongmei Zhang, Xiaodong Hu , Mingtao Li, Tong Zhang,  Lijun Zhou and Xianguo Liu. Protein Synthesis Inhibition Blocks the Late-Phase LTP of C-Fiber  Evoked Field Potentials in Rat Spinal Dorsal Horn. J Neurophysiol, 2003;89:2354- 2359
15 .  Juan Sun, Mingtao Li, Jiahuai Han and Jun Gu. Sensitization of differentiated PC12 cells to apoptosis by presenilin-2 is mediated by p38. Biochem. Biophy. Res. Commun., 2001, 287: 536-541.
16.   Weibin Cai, Jianfang Ma , Chaoyang Li, Zhonghan Yang, Xia Yang, Wei Liu , Zuguo Liu , Mingtao Li, Guoquan Gao. Enhanced anti-angiogenic effect of a deletion mutant of plasminogen kringle 5 on neovascularization. J Cell Biochem. 2005 Sep 15;(in press).
17.   Ming YANG, Cun-you WAGN, Feng ZHOU, Jing TAO, Tao LIU, Hai-yan WEI, Wei LIU, Ming-tao Li, Xian-song FENG.  Proteomic Analysis in the Early Process of Pancreatic Regeneration in the Pancreatectomized Rat.  Acta Pharmacologica Sinica 2005 (in press)
工 作 条 件
         2001年回国，获得211基金180万元，组建了一流的分子、细胞生物学实验室。2002年，作为负责人获得一期985学科建设经费700万元，筹建了一流的蛋白质组学实验室并正在主持开展蛋白质科学的前沿性工作。近三年，培养和汇聚了一支从事分子神经生物学和蛋白质组学研究的科研队伍。 这些建设性工作为解决细胞信号转导、基因调控以及本项目的核心问题奠定了扎实的基础。
      项目负责人黎明涛所在单位——中山大学基础医学院药理教研室是211项目资助学科和国家重点学科。人才济济，科研装备精良。近三年，药理教研室获得学科建设资金3000万元，已购置大型仪器如质谱仪、激光共聚焦显微镜、超速离心机、流式细胞仪、高效液相和蛋白质分离纯化系统等。这是申请者视为非常可贵的研究工作环境。
申请者简历
申请者和项目组主要成员
学历
研究工作简历
近期已发表与本项目有关的文章目录
获得学术奖励情况
在本项目中承担的任务。


   黎明涛 (Li Mingtao)
              项目负责人，中山大学基础医学院药理教研室教授，博士生导师，中山医学院蛋白质组学实验室主任。于1984年、1989年和1996年分别获得医学学士、硕士和博士学位。
              主要研究领域是神经元凋亡的信号转导、基因调控和蛋白质组学。在美国Department of Pharmacology, University of Colorado Health Sciences Center从事两年博士后研究（1999-2001），主攻凋亡的信号转导、基因调控和蛋白质组学。
              近五年发表了14篇SCI论文，其中：作为第一作者，在国际核心杂志Molecular and Cellular Biology(Impact Factor, 10.03)和 Journal of Neuroscience(IF, 8.4)发表了具有创新性的文章；作为通讯作者，最近在Neurosci Res(IF, 2.4) 和Neurosci Lett（IF，2.2）等期刊上发表了开拓性的文章。近五年（1998－2004）作为第一主持人获得13项基金，包括：4项国家自然科学基金；5项省自然科学基金；3项市基金；1项教育部基金。
    发表的相关论文
      1. Leyu Shi , Shoufang Gong, Zhongmin Yuan , Chi Ma, Yanling Liu, Chuanfu Wang , Wenming Li, Rongbiao Pi, Shoujian Huang, Ruzhu Chen , Yifan Han , Zixu Mao, and  Mingtao Li(通讯作者). Activity deprivation-dependent induction of the proapoptotic BH3-only protein Bim is independent of JNK/c-Jun activation during apoptosis in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2005, 375:7－12.
   2. ……
   3. ……


     皮荣标(Pi Rongbiao)
               33岁，博士学位，讲师。2002年毕业于中山大学，获神经药理学博士。同年赴香港科技大学生物化学系从事博士后研究，现在中山大学药学院任讲师。主要研究兴趣涉及神经保护药物的作用及其机制的研究。曾负责或参加包括国家自然科学基金等多项研究。已发表或待发表论著近20篇，其中SCI论文5篇。
              皮博士与本人合作达11年，有共同的研究趣向，作为共同作者发表多篇SCI论文。他掌握了本项目涉及的大部分实验方法和技术，尤其在腺病毒载体构建方面积累了经验（见文章）。主要负责腺病毒载体构建等工作。
     发表的相关论文
      1. Rongbiao Pi, Wenming Li, Nelson T.K.Lee, Hugh H.N.Chan, Yongmei Pu, Ling Nga Chan, Nikolaus J. Sucher, Doanld C. Chang, Mingtao Li and Yifan Han. Minocycline prevents glutamate-induced apoptosis of cerebellar granule neurons by differential regulation of p38 and Akt pathways. J Neurochem. 2004, 91:1212-1230.
     2. ……
     3. ……


申请项目同行评议意见反馈信
     黎明涛先生：   
             您好！您申请的项目经专家投票表决，同意资助。关于你的项目的同行评议意见如下： 1.    本项目在小脑颗粒细胞撤钾的离体凋亡模型中，发现了一种直接调节Bim的新转录因子SP1，申请人试图采用腺病毒转染技术、基因突变以及分子生物学方法进一步论证SP1是直接调控bim基因的这一假说。立项具有前言性，申请人工作基础好，并与美国Emory大学、香港大学有长期的合作条件，完全能够完成本项课题。建议优先资助。 2.    本项课题的立项依据较为充分，具有一定的学术创新及科学意义。研究内容明确、技术路线清晰、研究方法和方案可行。申请者有较高的学术水平，以及多次主持国家自然科学基金课题的经验。同时，申请者所在单位又有比较好的实验室及条件。建议给予资助。 3.    课题研究具有较好的工作基础，研究具有较高的学术价值，建议资助。 4.    同意资助。理由：该项目立论依据充分，其重要的意义表现在澄清撤钾诱导神经元凋亡时，Bim上调的细胞内信号转导机制。申请者有较好的研究基础和研究能力，项目的内容设置合适，重点突出，总体方案合理，技术路线可行，可资助。 5.     This is a nicely writen proposal with a clear aim and practical approaches. Further, the group has published results related to the current proposal, indicating the ability of the group to perform the experiments. 
获得资助的决定因素
工作基础好
学术创新性及学术价值
立项依据充分
研究内容明确
技术路线清晰
重点突出、方案合理
国际合作

祝大家新年快乐！  在新的一年获得更多基金！
基金答辩
充满自信、激情
仪表和体语
特点： 专家心理？按提前结束做准备！
准备充分     幻灯 小道具
口头表达     准确性、情感性、可信性和简明性
开门见山、突出主题    做什么？为什么？怎样做？
突出特色和创新


帕金森病治疗的新靶点及靛玉红衍生物的研究与开发
黎   明   涛
中山大学基础医学院



以JNK为靶治疗PD
1. 保护多巴胺能神经元

2. 改善行为学指标

3. 提高黑质多巴胺浓度



以JNK/CDK5/GSK3β为靶治疗PD
       JNK          Neurosci Res 2004, 48:195-202
                                     Drug News Perspect.2004 17(10):646-54
       GSK3β   Mingtao Li, et al,  unpublished data
           CDK5      PNAS USA 2003,100(23):13650-5

抑制JNK/CDK5/GSK3β的方案
   1.三种抑制剂联合
   2.一种抑制剂，“一石三鸟”

Indirubin-3'-oxime（靛玉红衍生物）
是CDK5、GSK-3β的抑制剂
Nat Cell Biol. 1999 1(1):60-7
J Biol Chem. 2001, 5;276(1):251-60





研究目标

   以JNK/CDK5/GSK3β为明确靶点，以靛玉红衍生物为抑制剂, 研发出一类毒性小、特异性高、作用强的治疗PD的新药物
研究内容
1. 筛选对JNK具有特异性抑制作用的靛玉红衍生物 (11个）
2. 筛选对黑质多巴胺神经元凋亡具有保护性干预作用的靛玉红衍生物 （8个）
3. 筛选对PD具有治疗作用的衍生物 （4个）
4. 药理、毒理研究
研究基础
1. 首次证实JNK是治疗PD的有效靶点
2.  证实GSK-3β是治疗PD的靶点之一
3. 发现靛玉红衍生物能够抑制JNK，对PD具有治疗作用
4. 15篇相关SCI文章

发表文章补充
Wiedmann M, Wang X, Tang X, Han M, Li M, Mao Z.         J Neurosci Res. 2005 Jun 1 [Epub ahead of print]
Wang X, Tang X, Li M, Marshall J, Mao Z.  J Biol Chem. 2005, 280(17):16705-13.
Li W, Pi R, Chan HH, Fu H, Lee NT, Tsang HW, Pu Y, Chang DC, Li C, Luo J, Xiong K, Li Z, Xue H, Carlier PR, Pang Y, Tsim KW, Li M, Han Y.   J Biol Chem. 2005, 280(18):18179-88.
创 新 点
       1. 首次证实JNK是治疗PD的有效靶点
       2.  证实GSK-3β是治疗PD的靶点之一
       3. 发现靛玉红能够抑制JNK，对PD具有治疗作用
       4. JNK/CDK5/ GSK-3β为靶治疗PD
       5. 用一种化合物抑制JNK/CDK5/ GSK-3β



我们对完成此项目充满信心！
谢   谢！

参 考 文 献
1.  Leyu Shi , Shoufang Gong, Zhongmin Yuan , Chi Ma, Yanling Liu,Chuanfu Wang , Wenming Li, Rongbiao Pi, Shoujian Huang, Ruzhu Chen , Yifan Han , Zixu Mao, and  Mingtao Li. Activity deprivation-dependent induction of the proapoptotic BH3-only protein Bim is independent of JNK/c-Jun activation during apoptosis in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2005, 375：7－12.
2. Wenya Wang, Leyu Shi, Yuanbin Xie, Chi Ma, Wenming Li, Xingwen Su, Shoujian Huang, Ruzhu Chen, Zhenyu Zhu, Zixu Mao, Yifan Han and Mingtao Li. SP600125, a new JNK inhibitor, protects dopaminergic neurons in the MPTP model of Parkinson’s disease.  Neurosci Res  2004；48:195-202
实事求是、追求真理的人文精神
             Dr. Jonathan Ham以撤NGF的交感神经元为模型观察到JNK/c-Jun[10]和PI3K/Akt/ FKHRL1通路参与Bim的上调[12]，而我们以撤钾处理CGNs为模型观察到，这两条通路不参与Bim的上调。显然，我们的研究结果不支持Dr. Ham的结论。但是，Dr.  Ham读了我们的文章初稿之后，在提出中肯意见的同时，称我们的实验结果非常清楚并对我们的上述结论表示认同(Overall your results are clear and suggest that altering the KCl concentration in CGNs induces the bim promoter by a mechanism that does not involve JNK / c-Jun or FOXO factors)。Dr.  Ham这种严谨的科学态度令人钦佩，值得学习（尊敬的评审专家，如有必要，本人可以将Dr. Ham的Email原件转发给您）。

工作基础 ：   
          本项目是在原工作基础上的继续和深入。近五年，本人共发表了12篇SCI论文，其中作为第一作者两篇；通讯作者四篇（见工作基础）。研究方向主要集中在神经元凋亡的信号转导和基因调控。本课题组在研究JNK/c-Jun通路靶基因时,发现“促凋亡蛋白bim上调不依赖JNK/c-Jun”。我们首次报道了神经元凋亡时JNK/c-Jun不参与bim的上调[1]，随后，我们又以可靠的证据揭示了PI3K/Akt/ FKHRL1也不介导bim的上调(未发表资料)。最近，对bim的调控研究又取得了突 破性的进展，即发现了SP1调控bim的转录机制(见立项依据)。这些研究工作改变了以往的观点,也是本项目重要的立项依据之一。因此，我们具有完成本项目的切实可行的、扎实的前期工作基础。


负显性SP1腺病毒(Ad-dnSP1)载体的构建、扩增、纯化和保存
基本方法

      大鼠小脑颗粒神经元培养、Western blot、RT－PCR、钙磷沉淀法转染基因、转基因神经元的凋亡分析、报道基因表达分析、免疫沉淀等基本方法均按我们报道[1, 2, 3, 4, 5, 6]的进行。